样本收集及储存等资料

样本收集及储存

1. 细胞培养上清：将细胞培养基移至无菌离心管，在4°C条件下1000Xg离心20min，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。
2. 血清样本：室温下血液自然凝固后，在4°C条件下1000Xg离心20min，取上清即可检测。
3. 血浆样本：将全血收集到含抗血凝剂的管中，抗凝剂推荐使用EDTA钠盐，样品采集后30min内于1000Xg离心15min，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。
4. 组织匀浆：用预冷的PBS（0.01M,pH=7.4）冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。
5. 将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）
6. 加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎。
7. 最后将匀浆液5000Xg离心5-10min，取上清检测。
8. 细胞提取液：贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000Xg离心5min后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。
9. 收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每1×106个细胞中加入150-200μlPBS重悬并通过反复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500Xg离心10min，取上清检测。

 

※注意：

1. 样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4°C，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20°C(1个月内检测)，或-80°C(3个月内检测)，避免反复冻融。
2. 试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围，如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议查阅文献后先做预实验，以确定稀释倍数)。
3. 若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。
4. 若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。
5. 某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。

 

试剂准备

1. 试剂回温：在实验前20min将试剂盒、待测样本放置于室温下。读数前15min打开酶标仪预热。
2. 配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将25倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液。提示：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40°C水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液。当日使用。
3. 标准品梯度稀释：标准品于10000Xg离心1min，加入标准品&样品稀释液1．0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10min，上下颠倒数次，待其充分溶解后，轻轻混匀，配成500pg/mL的标准品工作液。然后根据需要进行稀释。建议配制成以下浓度：500,250,125,62.5,31.25,15.63,7.81,0pg/mL。倍比稀释方法：取7支EP管，每管中加入500μl标准品&样品稀释液，从500pg/mL的标准品工作液中吸取500μl到其中一支EP管中混匀配成250pg/mL的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。具体稀释如下图S1-S8。提示：最后一管直接作为空白孔，不需要再从倒数第二管中吸取液体
4. 生物素标记抗体工作液：预先计算好试验所需用量(以100μl/孔计算)，用稀释液SD2将100倍生物素标记抗体浓缩液稀释成1倍工作液（稀释前充分混匀），请在30min内加入到反应孔中。
5. HRP标记链霉亲和素：按每次试验所需用量配制(以100μl/孔计算)，用稀释液SD3将100倍浓缩HRP标记链霉亲和素稀释成1倍应用工作液（稀释前离心），请在30min内使用。
6. 洗涤方法：自动洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，注入洗涤液为350μl/孔,注入与吸出间隔为30s，洗板5次。手工洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液350μl/孔，静止1-2min后甩净酶标板孔中液体，在厚迭的吸水纸上拍干，洗板5次。

操作程序
※正式测定前请务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

1. 预先计算好所需的板条数，实验前30min，拿出试剂盒，恢复至室温。
2. 每个反应孔中加入100μl标准品工作液及检测样本（若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样），标准品需做复孔，封板后于37°C孵箱孵育90min。提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间控制在10min内。
3. 弃去液体，甩干，每个反应孔中加入100μl生物素标记Agouti相关蛋白抗体工作液至反应孔中，封板后于37°C孵箱孵育60min。
4. 洗涤：弃去液体，甩干，每个反应孔中加入350μl洗涤液，浸泡1-2min，甩干洗涤液。重复4次。
5. 每个反应孔中加入100μlHRP标记链霉亲和素工作液至反应孔中，封板后于37°C孵箱孵育30min。
6. 洗涤：每个反应孔中加入300μl洗涤液，间隔30s，甩干洗涤液。重复4次。
7. 每个反应孔中加入90μl显色剂（避光）至反应孔中，封板后于37°C避光显色15min左右。
8. 每个反应孔中加入50μl终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5min内）。
9. 用酶标仪450nm波长测定OD值。
10. 计算标准品、样品的平均OD值：每个标准品和样本的OD值应减去零孔的OD值。
11. 以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用“四参数logistics模型”绘制标准曲线。（作图时去掉空白组的值）
12. 若样本OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。