该免疫印迹实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

阻断

1. 使用 5% 脱脂奶粉溶于 1X TBST 作为阻断缓冲液。

2. 使用足够多的阻断缓冲液确保凝胶被完全覆盖。

3. 室温下阻断并震荡1小时。

冲洗

1. 1X TBST 中冲洗3次，每次4分钟，然后1X TBS中冲洗3次，每次4分钟。

2. 确保在盒子里一直都有足够的冲洗缓冲液。

一抗孵育

1. 将一抗在 TBST中稀释。

2. 室温下震荡孵育 2 小时。

3. 时而检查凝胶确认其完全被抗体溶液覆盖。

冲洗

1. 1X TBST 中冲洗3次，每次4分钟，然后1X TBS中冲洗3次，每次4分钟。

2. 确保在盒子里一直都有足够的冲洗缓冲液。

二抗孵育

1. 在1X TBST (浓度根据使用的抗体而定) 中制备二抗。

2. 室温下震荡孵育 1 小时。

3. 时而检查凝胶确认其完全被抗体溶液覆盖。

冲洗

1. 1X TBST 中冲洗3次，每次4分钟，然后1X TBS中冲洗3次，每次4分钟。

2. 确保在盒子里一直都有足够的冲洗缓冲液。

检测

ECL检测试剂的用量取决于凝胶的大小. 通常来说, 用量需要足够完全覆盖凝胶。

1. 1:1 混合溶液 A 和溶液 B。

2. 用镊子夹起凝胶，轻轻拍在无尘擦纸上，去除凝胶上多余的 Tris。

3. 把凝胶放在新的干净的盒子里，加入检测试剂，确保凝胶均匀的被覆盖。

4. 在黑暗中孵育凝胶 5 分钟。

5. 用镊子夹起凝胶，用无尘擦纸洗掉多余的试剂。

6. 凝胶成像。